小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核的測定方法

實驗原理

    染色單體或染色體的無著絲點斷片，或因紡錘體受損而丟失的整個染色體，在細胞分裂后期，仍然在細胞質中。末期之后，單獨形成一個或幾個規則的次核，被包含在子細胞的胞質內，因比主核小，故稱為微核。大小應為主核的1/20～1/5。微核的折光率及細胞化學反應性質和主核一樣。微核率是和用藥的劑量或輻射累積效應呈正相關，所以可用簡易的、快速、靈敏的微核計數來代替繁雜的畸變染色體計數。Matter 和Schmid建立的微核測試是一種比較理想的方法，目前國內外已把微核測試用于輻射損傷、化學誘變劑、新藥試驗、染色體遺傳疾病及癌癥前期診斷等各方面。

    嗜多染紅細胞是分裂后期的紅細胞由幼年發展為成熟紅細胞的一個階段，此時紅細胞的主核已排出，因胞質內含有核糖體，Giemsa染色呈灰藍色，成熟紅細胞的核糖體已消失，被染成淡橘紅色。骨髓中嗜多染紅細胞數量充足，由于無核，極易觀察到微核，因此，骨髓中嗜多染紅細胞成為微核試驗的細胞群。

實驗對象

成年健康小鼠，體重25g左右，雌雄均可。

elisa試劑盒實驗試劑與器材

（1）器材：顯微鏡、低速離心機、電子天平、解剖器械（搪瓷解剖盤、探針、剪刀、鑷子）、注射器、試管、試管架、磨口試劑瓶、滴管、染色缸、洗耳球、量筒、清潔載玻片。

（2）試劑：0.9％生理鹽水、滅活的小牛血清、環磷酰胺、甲醇、PBS (pH6.8)、Giemsa染液、瑞氏染液。

實驗方法與步驟

（1）環磷酰胺處理：取骨髓前24h先給小鼠腹腔注入環磷酰胺，注射劑量為100mg／kg動物體重。

（2）取骨髓：用損傷脊髓法處死小鼠，然后用剪刀剪開大腿上的皮膚和肌肉，取出大腿骨，用一小塊紗布來回搓干凈附在骨上的肌肉碎渣。剪掉股骨兩端膨大的關節頭，然后用注射器吸取5ml生理鹽水，插入股骨一端，將骨髓細胞沖洗至10ml的離心管中。可重復沖洗多次，直至骨髓腔呈白色為止。

（3）離心處理：將所獲得的細胞懸浮液以 1000rpm離心10min，吸去上清液，在沉淀物中加入2滴滅活的小牛血清，制成細胞懸液。

（4）涂片：滴一滴懸液于載玻片一端，按常規方法涂片，在空氣中晾干。

（5）固定：將晾干的載玻片放入甲醇固定液中10min，取出晾干。

（6）染色：將制片平放在玻璃板上，用1∶9∶10的 Giemsa∶PBS∶瑞氏染液，染色15min，流水沖洗后晾干即可鏡檢。

（7）觀察：嗜多染紅細胞為年幼紅細胞，呈灰藍色，略大于紅細胞（紅色），微核多呈圓形和橢圓形，呈藍紫色或紫紅色（圖13-3）。

（8）結果分析：在顯微鏡下，每只小鼠骨髓涂片標本計數1000~2000個嗜多染紅細胞，包括其中出現微核的細胞數，將結果填入表內，并計算微核細胞率，觀察記錄結果（表13-2）。

按100mg/kg體重劑量給小鼠腹腔注射環磷酰胺，其嗜多染紅細胞微核率為（48.9±3.6）％。正常小鼠嗜多染紅細胞微核率為5‰以下，超過5‰為異常。