ELISA操作指南——酶免疫測定

酶免疫測定(enzyme immunoassay,EIA)，是將酶催化作用的高效性與抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合的一種微量分析技術(shù)。酶標(biāo)記抗原抗體后形成的酶標(biāo)記物，既保留抗原或抗體的免疫活性，又保留酶的催化活性。當(dāng)酶標(biāo)記物與待測樣品中相應(yīng)的抗原或抗體相互作用時(shí)，可形成酶標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物。利用復(fù)合物上標(biāo)記的酶催化底物顯色，其顏色深淺與待測樣品中抗原或抗體的量相關(guān)。該方法靈敏度可達(dá)到ng~pg/ml水平。常用的標(biāo)記物有辣根過氧化物酶HRP和堿性磷酸酶AP等。酶免疫測定分為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和酶免疫組化技術(shù)(enzyme immunohistochemistry technique)，前者用于測定可溶性抗原或抗體，后者用于測定組織或細(xì)胞表面的抗原。

酶免疫技術(shù)

均相酶免疫測定技術(shù)

以標(biāo)記抗體檢測標(biāo)本中的抗原為例，按照簡單的形式在試劑抗體過量的情況下進(jìn)行：

　　Ab*+Ag—Ab*Ag+Ab*

如在抗原抗體反應(yīng)后Ab*Ag中的標(biāo)記物“*"失去其特性，例如酶失去其活性，則不需要進(jìn)行Ab*Ag與Ab*的分離，可以直接測定游離的Ab*量，從而間接推算出標(biāo)本中的Ag含量，這種方法稱為均相酶免疫測定。

均相酶免疫測定的測定對象為小分子抗原或半抗原，主要用于藥物測定。均相酶免疫測定的測定模式為競爭抑制法，酶標(biāo)記的是待測抗原，檢測試劑中尚有針對待測抗原的抗體和酶的底物。與抗體結(jié)合的酶就失去其活力，因此在反應(yīng)中無需分離結(jié)合的酶與游離的酶即可進(jìn)行測定。其反應(yīng)過程與一般的生化測定無異，因此可直接用自動生化分析儀進(jìn)行測定。均相酶免疫測定主要有酶擴(kuò)大免疫測定技術(shù)和克隆酶供體免疫測定兩種。

異相酶免疫測定技術(shù)

酶免疫技術(shù)是以酶標(biāo)記的抗體或抗原為主要試劑進(jìn)行檢測的方法，是標(biāo)記免疫技術(shù)的一種，1966年Nakene和Pierce利用酶使底物顯色的作用而得到與熒光抗體技術(shù)相似的結(jié)果，20世紀(jì)70年代初，酶標(biāo)抗體技術(shù)開始應(yīng)用于免疫測定，其后得到迅速發(fā)展。近年來標(biāo)記免疫技術(shù)飛速發(fā)展，應(yīng)用不同標(biāo)記物，根據(jù)不同原理、不同技術(shù)建立起來的檢測方法層出不窮。

酶免疫測定(enzymeimmunoassay，EIA)是以酶作為標(biāo)記物的免疫測定方法，利用酶的高效催化作用提高檢測的敏感度。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后是否需要分離結(jié)合的與游離的酶標(biāo)記物，酶免疫測定可分為均相(homogenous)和異相(heterogenous)兩種類型。相對于均相酶免疫測定技術(shù)，異相酶免疫測定在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)應(yīng)用更為廣泛，其反應(yīng)過程中需經(jīng)過結(jié)合標(biāo)記物和游離標(biāo)記物的分離才能進(jìn)行測定。分離的方法主要借助固相載體，即將一種反應(yīng)物固定在固相載體上，當(dāng)另一種反應(yīng)物與之結(jié)合后，可通過洗滌、離心等方法令其與液相中的其他物質(zhì)分離，此類反應(yīng)亦稱為固相酶免疫測定。Engvall和Perimann于20世紀(jì)70年代初首先建立這種方法，稱之為ELISA。所謂的免疫吸附劑指的是吸附在固相載體上的免疫活性物質(zhì)ELISA在臨床及科研中應(yīng)用極為廣泛，已成為固相酶免疫測定的代名詞。

固相酶免疫測定方法

固相酶免疫測定主要是指ELISA，其基本原理是：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面(包被)，并保持其免疫活性；用酶標(biāo)記(另一種)抗原或抗體，保留其免疫活性和酶活性；在測定時(shí)，把待測標(biāo)本(測定其中的抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)；用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例；加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化顯色，故可根據(jù)顏色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，具有放大反應(yīng)的效果，從而使測定方法達(dá)到很高的敏感度。根據(jù)測定對象的不同，ELISA有多種反應(yīng)類型。