細胞凍存方法

細胞凍存的一般方法 
 
開始細胞凍存前，仔細檢查細胞凍存所需的儀器和試劑是否齊全：一般主要有：傳代細胞單層、適宜生長液、滅活小牛血清、慶大霉素溶液、7.5％NaHC03溶液、0.25％胰蛋白酶溶液、標簽用具：100ml方瓶（培養細胞用）、克氏瓶、紅翻帽塞、吸管（10ml、lml）、細胞凍存管、二甲基亞砜、CO2孵箱、超掙臺、倒置顯微鏡、2～8℃冰箱、-20℃冰箱、液氮罐

操作步驟

鏡檢細胞，挑選培養3～4天的細胞，生長狀態良好，無污染、異常及可疑病變細胞。配制細胞培養液：根據不同的細胞需用不同的基礎液，培養液配方為（基礎液：7.5%碳酸氫鈉：1萬單位慶大霉素=100：1：0.25）。制備細胞懸液：挑選培養3—4天的細胞，細胞界限清晰，具有立體感，細胞形態良好的單層細胞瓶，棄去培養液，先用PBS洗液沖洗細胞表面1-2次，再向克氏瓶中加入0.25%胰酶8ml，等細胞面開始出現裂縫時倒掉瓶中部分胰酶，大克氏瓶中保留2 ml，放置幾分鐘使細胞*脫落到胰酶中，收集含細胞的胰酶，并用培養液沖洗細胞瓶3-4次，收集沖洗液；向收集液中補加以下物質：小牛血清使終濃度為20%、二甲基亞砜使終濃度為9%；分裝：將細胞懸液混勻后，立即分裝于細胞凍存管中，每管按1～1.6ml的量分裝，擰緊管蓋；在凍存管上做好標記，包括細胞代號及凍存日期等。

凍存

先將凍存管放入普通冰箱冷藏室（2～8℃），約3-4h；接著將凍存管置于普通冰箱冷凍室，約3-4 h；然后將凍存管放置液氮灌口，過夜；zui后將凍存管投入液氮保存。記錄：記錄內容包括凍存日期、細胞代號、凍存管數、凍存過程中降溫的情況、凍存位置以及操作人員。




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